Κατάψυξη ωαρίων και σπέρματος

 

Κατάψυξη ωαρίων

Σε  μια  προσπάθεια  εξωσωματικής  γονιμοποίησης (IVF)  δημιουργούνται  πολλά  ωάρια ώστε  να αυξάνεται η πιθανότητα  εγκυμοσύνης. Όταν πρόκειται να  γίνει η  εμβρυομεταφορά,  επιλέγουμε να μεταφέρουμε στη μητέρα  τα  “καλύτερα” ως προς την ποιότητα  έμβρυα. Για  τους  εμβρυολόγους, τα “καλύτερα” είναι  τα  έμβρυα  με  την  υψηλότερη  πιθανότητα  να  εμφυτευθούν  και  να  δώσουν  ένα  υγιές  μωρό. Τα  υπόλοιπα  έμβρυα, αν  ο  ρυθμός  ανάπτυξής τους  και  η  ποιότητά τους  το  επιτρέπουν, καταψύχονται.

Πολύ συχνά βλέπουμε ότι μπορούν να γεννηθούν δύο ή και τρία παιδιά μετά από μία ωοληψία της μητέρας τους. Πιο συγκεκριμένα, η  μητέρα να έχει  μείνει έγκυος  μετά  την  πρώτη  εξωσωματική και  αφού γεννήσει, για το δεύτερο παιδί, να γίνει η εμβρυομεταφορά των κρυοσυντηρημένων εμβρύων, χωρίς να χρειαστεί να πάρει επιπλέον φάρμακα για ωοθηκική διέγερση.

Εάν η  πρώτη  προσπάθεια  εξωσωματικής  αποτύχει, τότε  τα  κατεψυγμένα  έμβρυα  επιτρέπουν  να  κάνουμε ακόμη μια  δεύτερη προσπάθεια χωρίς η  γυναίκα  να  χρειαστεί  να  πάρει  φάρμακα  και  να  κάνει  δεύτερη ωοληψία.

Εκτός από έμβρυα, μπορούμε  να  καταψύξουμε  και αγονιμοποίητα ωάρια.

Στο παρελθόν, η  κατάψυξη ωαρίων  δεν  είχε  πολύ  καλά  αποτελέσματα  λόγω των τεχνικών της αργής κατάψυξης (slow freezing) που χρησιμοποιούσαμε.  Σήμερα χρησιμοποιούμε την μέθοδο της υαλοποίησης (Vitrification), που  είναι μια ασφαλής μέθοδος κρυοσυντήρησης με εντυπωσιακή αποτελεσματικότητα απόψυξης και πολύ υψηλά ποσοστά εγκυμοσύνης .

Επίσης, η κατάψυξη ωαρίων  δίνει  τη δυνατότητα στις γυναίκες  που  δεν  έχουν  αποφασίσει  το  πότε  θα  κάνουν  παιδί ή  στις  γυναίκες  που  δεν  έχουν βρει  ακόμη  τον κατάλληλο σύντροφο να καταψύχουν τα ωάριά τους ώστε να μπορούν να  να γίνουν μητέρες αργότερα. Η ηλικία  της  γυναίκας  επηρεάζει  κυρίως  την  ποιότητα και  τον  αριθμό  των  ωαρίων της με τη  μέθοδος  της  κατάψυξης  με vitrification δίνει τη δυνατότητα σε  πολλές  γυναίκες να καθυστερήσουν τη μητρότητα.

Με αυτή τη μέθοδο,  μία γυναίκα μπορεί να διατηρήσει τη γονιμότητά της  ακόμη και σε περίπτωση που χρειάζεται ιατρική θεραπεία (όπως χημειοθεραπεία, ακτινοβολία κ.α.) η οποία μπορεί να την επηρεάσει. Σε ολόκληρο τον κόσμο έχουν γεννηθεί πολλά παιδιά με τη μέθοδο της κρυοσυντήρησης ωαρίων, η οποία  έχει  παρόμοια ποσοστά επιτυχίας με τη χρήση νωπών ωαρίων.

Πολύ ενδιαφέρουσα εργασία αποδεικνύει ότι ο χρόνος που τα κρυοσυντηρημένα έμβρυα βρίσκονται στην κατάψυξη δεν φαίνεται να επηρεάζει τα ποσοστά κύησης.

 

Κρυοσυντήρηση σπέρματος και ορχικού ιστού

 

Η κρυοσυντήρηση σπέρματος αποτελεί μία διαδικασία ρουτίνας στη σύγχρονη Ιατρική και πιο συγκεκριμένα στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή.

 

Πρόκειται για τη διατήρηση κυττάρων και ιστών σε πολύ χαμηλές θερμοκρασίες στις οποίες αναστέλλεται η βιολογική τους δραστηριότητα. Το αποτέλεσμα είναι να διατηρούνται αναλλοίωτα για μεγάλα χρονικά διαστήματα.

Στον τομέα της υποβοηθούμενης αναπαραγωγής (στη σπερματέγχυση, στην εξωσωματική γονιμοποίηση και στη μικρογονιμοποίηση), πρόκειται για μία ευρέως χρησιμοποιούμενη μέθοδο, καθώς επιτρέπει τη χρήση του σπέρματος μεταγενέστερο χρόνο για την επίτευξη εγκυμοσύνης, όπως παραδείγματος χάρη όταν η φυσιολογική ποιότητα του σπέρματος θα έχει επιδεινωθεί, όταν δεν θα υπάρχουν καθόλου σπερματοζωάρια, σε περίπτωση που ο δότης δεν μπορεί να είναι παρών την ημέρα της ωοληψίας ή αν ο δότης δυσκολεύεται να δώσει δείγμα σε συγκεκριμένο χρόνο λόγω άγχους.

Η κρυοσυντήρηση σπέρματος αποτελεί μία διαδικασία επιλογής σε άνδρες που βρίσκονται στη διαδικασία υποβοηθούμενης αναπαραγωγής, αλλά εμφανίζουν δυσκολίες κατά τη συλλογή σπέρματος, εσχάτως και για τους άνδρες που κινδυνεύουν περισσότερο από COVID-19, καθώς η νόσηση απο κορονοϊό μπορεί βραχυπρόθεσμα να επηρεάσει την ποιότητα του σπέρματος.

Η συλλογή και η κατάψυξη σπέρματος είναι επίσης χρήσιμη για να μην χρειάζεται ο δότης να υποβάλλεται σε διαδικασία συλλογής σπερματοζωαρίων σε κάθε κύκλο εξωσωματικής.

Η δε κρυοσυντήρηση ορχικού ιστού αποτελεί επιλογή για άνδρες με ολιγο- ή ασθενοζωοσπερμία, ώστε να αποφεύγονται οι επαναλαμβανόμενες βιοψίες. Επίσης, με τον τρόπο αυτό αποφεύγεται η δυσάρεστη έκπληξη της μη ανεύρεσης σπερματοζωαρίων την ημέρα της ωοληψίας.

 

Ογκολογικοί ασθενείς

Η κρυοσυντήρηση αποτελεί μία επιλογή για τους ογκολογικούς ασθενείς που πάσχουν από διάφορες μορφές καρκίνου και πρόκειται να υποβληθούν σε γοναδοτοξικές θεραπείες, οιοποίες οδηγούν σε προσωρινή ή μόνιμη απώλεια της γονιμότητάς τους, αλλά και για τους πάσχοντες από καρκίνο του όρχεος, ο οποίος αποτελεί τον πιο συχνό καρκίνο στους νέους άνδρες, και τα τελευταία χρόνια στην πλειοψηφία των περιπτώσεων οδηγείται σε πλήρη ίαση.

Η διατήρηση της μελλοντικής γονιμότητας αυτών των ανδρών είναι πολύ σημαντική. Και ευτυχώς τα τελευταία χρόνια υπάρχει ιδιαίτερη ευαισθητοποίηση από πλευράς των θεραπόντων ιατρών, οι οποίοι ενημερώνουν αναλόγως τους ασθενείς για τη διαδικασία που τους δίνει τη δυνατότητα απόκτησης των δικών τους παιδιών στο μέλλον.

Σε αυτό το σημείο, θα πρέπει να σημειώσουμε ότι η υπογονιμότητα στους άνδρες με καρκίνο του όρχεος δεν είναι αποτέλεσμα μόνο των θεραπευτικών χειρισμών, αλλά ενίοτε και της ίδιας της νόσου- π.χ. λόγω του χαμηλού επιπέδου των ορμονών της αναπαραγωγής, των ενδοκρινών ουσιών που παράγει ο όγκος κ.ο.κ.

Πέρα από τις πρακτικές, ψυχολογικές προεκτάσεις υπάρχουν στη συγκεκριμένη διαδικασία. Αυτό διότι δίνει την αίσθηση στους νεαρούς ασθενείς, που περνούν μία σημαντική κρίση υγείας, ότι θα συνεχίσουν κανονικά τη ζωή τους μετά από όλη αυτή την περιπέτεια.

 

Άλλες περιπτώσεις

Η κατάψυξη σπέρματος ενδείκνυται επίσης για τους άντρες που πάσχουν από Μεσογειακή Αναιμία, καθώς λαμβάνουν θεραπείες που έχουν συνδεθεί με τερατογένεση. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η λήψη του σπέρματος γίνεται σε κατάλληλο χρονικό διάστημα, όπου υπάρχει διακοπή ή τροποποίηση του θεραπευτικού σχήματος, ώστε να μπορεί να ληφθεί δείγμα με ασφάλεια.

Ακόμη, μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ασθενείς που πρόκειται να υποβληθούν σε μεταμόσχευση οργάνων ή θεραπείες που μπορεί να θέσουν σε κίνδυνο την σπερματογενετική τους τους ικανότητα.

Σε κάποιες χώρες, συστήνεται η κατάψυξη σπέρματος σε άνδρες που ασκούν επικίνδυνα επαγγέλματα.

Τέλος, η κρυοσυντήρηση σπερματοζωαρίων ενδείκνυται για τους άντρες που πρόκειται να υποβληθούν σε απολίνωση σπερματικών πόρων με στόχο την αντισύλληψη.

 

Χθες & σήμερα

Η κρυοσυντήρηση σπέρματος εφαρμόστηκε για πρώτη φορά στη δεκαετία του 1950 και σήμερα αποτελεί μία ευρέως διαδεδομένη διαδικασία.

Η ιδέα είχε γεννηθεί πολύ νωρίτερα, το 1866 από τον Montegazza. Ο Montegazza  είχε προτείνει τη δημιουργία τράπεζας για τη διατήρηση του σπέρματος στρατιωτών, προκειμένου τα δείγματα να χρησιμοποιηθούν από τις συζύγους τους, σε περίπτωση που εκείνοι δεν επέστρεφαν από τον πόλεμο¹.

Στα πρώτα χρόνια της διαδικασίας, η κρυοσυντήρηση γινόταν σε ξηρό πάγο. Ωστόσο, τότε είχε παρατηρηθεί ότι σε αυτές τις συνθήκες η κινητικότητα των σπερματοζωαρίων διαρκώς μειωνόταν. Τα δεδομένα άλλαξαν με τη χρήση υγρού αζώτου και την κρυοσυντήρηση των κυττάρων στους -196^οC.

Η μεγάλη πρόκληση για τα κύτταρα δεν ήταν να διατηρηθούν σε βιώσιμη κατάσταση στις χαμηλές θερμοκρασίες, αλλά να αντέξουν την ψύξη και την απόψυξη. Για τον λόγο αυτό, αναπτύχθηκαν διάφορες κρυοπροστατευτικές χημικές ουσίες.

Στην αποτελεσματικότητα της διαδικασίας έχει συμβάλλει καθοριστικά συν τω χρόνω η πρόοδος της τεχνολογίας και η χρήση ειδικών κρυοπροστατευτικών ουσιών που βελτιώνουν τη βιωσιμότητά τους μετά την απόψυξη. Οι ουσίες αυτές προστατεύουν τους βιολογικούς ιστούς από την καταστροφή κατά τη διαδικασία της κατάψυξης.

Η πρώτη κρυοπροστατευτική ουσία που χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία της κρυοσυντήρησης για την προστασία των σπερματοζωαρίων κατά την κατάψυξη ήταν η γλυκερόλη.

Πολύ σημαντικός είναι και ο ρυθμός με τον οποίο κατεβαίνει η θερμοκρασία στο δείγμα για να φτάσει στους -196^οC.

Η πρώτη εγκυμοσύνη με τη χρήση κατεψυγμένου σπέρματος επετεύχθη το 1953, ενώ η πρώτη γέννηση παιδιού από κατεψυγμένο σπέρμα χρονολογείται είκοσι χρόνια αργότερα, στο 1973. Το μεγαλύτερο διάστημα χρήσης επιτυχούς κρυοσυντήρησης που έχει αναφερθεί στην ιστορία της Ιατρικής είναι 21 χρόνια.

Πρόσφατα μάλιστα, η Human Fertilization and Embryology Αuthority αποφάσισε να παρατείνει τον επιτρεπόμενο χρόνο κρυοσυντήρησης σπέρματος στα 55 χρόνια.

 

Τεχνικές

Υπάρχουν πολλές τεχνικές που χρησιμοποιούνται σήμερα για τη διασφάλιση της ασφαλής συντήρησης των δειγμάτων και με στόχο την καλύτερη βιωσιμότητα και κινητικότητα των σπερματοζωαρίων μετά την απόψυξη: η κρυοσυντήρηση μαζί με σπερματικό πλάσμα, η χρήση αντιοξειδωτικών ουσιών, όπως της κερσετίνης, που βελτιώνει την κινητικότητα και βιωσιμότητα των σπερματοζωαρίων, αλλά και η χρήση ουσιών που ενεργοποιούν την κινητικότητα των σπερματοζωαρίων μετά την απόψυξη.

Μία από τις νεότερες τεχνολογίες που έχουν εφαρμοστεί στην συντήρηση σπέρματος είναι αυτή της υαλοποίησης (vitrification). Η υαλοποίηση φαίνεται να ξεπερνά με μεγάλη επιτυχία δύο από τις δυσκολίες που αντιμετώπιζαν μέχρι σήμερα οι επιστήμονες, τη δημιουργία ενδοκυτταρικού πάγου και τη μείωση του στρες που δέχονται τα κύτταρα κατά τις διαδικασίες της κατάψυξης και της απόψυξης.

H υαλοποίηση είναι μία τεχνική στην οποία τα εργαστήρια διαθέτουν εξαιρετική εμπειρία, καθώς έχει εφαρμοστεί εκτεταμένα για την κατάψυξη ωαρίων και εμβρύων με εξαιρετικά αποτελέσματα³.

Η εξέλιξη στις τεχνικές έχει βελτιώσει τόσο πολύ τα πράγματα, που σήμερα, τα ποσοστά κύησης στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή με κατεψυγμένο σπέρμα δεν διαφέρουν σημαντικά από τις προσπάθειες όπου έχει χρησιμοποιηθεί νωπό σπέρμα.

Η περαιτέρω βελτίωση αυτών των τεχνικών αποτελεί στόχο των επιστημόνων, καθώς η καλύτερη προστασία των σπερματοζωαρίων θα μεταφραστεί σε ακόμη μεγαλύτερες πιθανότητες επιτυχίας.

 

Κρυοσυντήρηση σπερματοζωαρίων από τον όρχι

Ιδιαίτερη προσοχή απαιτείται στην κρυοσυντήρηση δειγμάτων που περιέχουν μικρό αριθμό σπερματοζωαρίων, όπως για παράδειγμα τα δείγματα που έχουν προέλθει από τον όρχι ή από την επιδιδυμίδα με χειρουργικές μεθόδους.

Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται συνήθως σε άνδρες με αζωοσπερμία. Η αζωοσπερμία μπορεί να είναι είτε αποφρακτική, όπου υπάρχουν σπερματοζωάρια τα οποία δεν μπορούν να βγουν με την μορφή σπέρματος, είτε μη αποφρακτική, όπου παρατηρείται πρόβλημα με τη διαδικασία της σπερματογένεσης.

Συχνή αιτία υπογονιμότητας στους άνδρες αποτελεί και η κιρσοκήλη. Επειδή όμως, ακόμη και μετά τη διόρθωση της κιρσοκήλης, η αζωοσπερμία μπορεί να επανέλθει, είναι σημαντικό ο άνδρας να ενημερώνεται και να προχωρά σε κατάψυξη σπερματοζωάριων μετά την επέμβαση αντιμετώπισής της.

Σε αυτές τις –δύσκολες- περιπτώσεις, όπου έχουμε λίγα σπερματοζωάρια, είναι εξαιρετικά σημαντικό να γίνονται ειδικοί και λεπτοί χειρισμοί.

Η μέθοδος της μικρογονιμοποίησης (ICSI -intra cytoplasmic sperm injection) ξεκίνησε το 1993. Προσέφερε σε άνδρες που έπασχαν από αζωοσπερμία και θεωρούντο στείροι, τη δυνατότητα να αποκτήσουν παιδί μέσω της ανάκτησης λίγων σπερματοζωαρίων από τους όρχεις τους. H ICSI έχει πρακτικά καταργήσει τις προϋποθέσεις, τα ελάχιστα κριτήρια που ίσχυαν κάποτε για την κρυοσυντήρηση των σπερματοζωαρίων, όπως την κινητικότητα 10% μετά από την απόψυξη και τη συγκέντρωση σπέρματος 10×10 ανά ml.

Αισιόδοξα είναι τα δεδομένα δημοσίευσης των Hauser et al. που μελέτησαν 13 ζευγάρια αζωοσπερμία εικόνα ανδρών όπου μετέβη είχαν βρεθεί λίγα κινούμενα ή ακίνητα σπερματοζωάρια και οι γυναίκες υπεβλήθησαν σε δύο μικρογονιμοποιήσεις (ICSI), μία με φρέσκα και μία με κατεψυγμένα σπερματοζωάρια που είχαν ληφθεί κατά την αρχική βιοψία όρχεων, και δεν διαπιστώθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο ομάδων ούτε στα ποσοστά γονιμοποίησης, ούτε στα ποσοστά εγκυμοσύνης.

Ξεχωριστή κατηγορία αποτελούν τα σπερματοζωάρια που εξάγονται με τη μέθοδο micro TESE, καθώς η αποθήκευσή τους σε φιαλίδια /σωληνάρια έχει ως αποτέλεσμα κάποιες φορές μέσα στο δείγμα να μην υπάρχει κανένα σπερματοζωάριο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, τα σπερματοζωάρια φυλάσσονται μαζί με τον ιστό που τα περιέχει.

Στην επιδιδυμίδα τέλος, εφαρμόζεται η τεχνική MESA, κατά την οποία η εξαγωγή των σπερματοζωαρίων γίνεται με μικροχειρουργική αναρρόφηση.

Μία άλλη κατηγορία αποτελούν οι ασθενείς με καρκίνο του όρχεος. Σε αυτούς τους ασθενείς διερευνάται το υγιές παρέγχυμα του αφαιρεθέντος όρχι για ώριμα σπερματοζωάρια ή γίνεται βιοψία του υγιούς όρχι.

 

Κατάψυξη & απόψυξη

Μεγάλη επιστημονική πρόκληση συνιστά και η κρυοσυντήρηση ολόκληρων τεμαχίων ορχικού ιστού , λόγω της διαφορετικής βιολογικής του σύστασης σε σχέση με το σπέρμα. Στόχος είναι η διατήρηση της λειτουργικής ακεραιότητας του ιστού μετά την απόψυξη.

Ιδιαίτερη προσοχή απαιτούν τα σπερματοφόρα σωληνάρια, που έχουν την τάση να συγκρατούν νερό -το οποίο με την κρυοσυντήρηση θα δημιουργήσει πάγο, ο όποιος δυνητικά μπορεί να οδηγήσει σε καταστροφή της δομής των σωληναρίων.

Για τους ίδιους λόγους, μεγάλη πρόκληση συνιστά και η απόψυξη του ιστού. Γενικά. η απόψυξη απαιτεί προσοχή, είτε αυτή αφορά σπέρμα, είτε ιστό, καθώς οι απότομες θερμικές αλλαγές μπορεί να έχουν επίπτωση στην ποιότητα των δειγμάτων.

Ακόμη όμως και στις περιπτώσεις όπου δεν υπάρχουν καθόλου κινούμενα σπερματοζωάρια μετά την απόψυξη μπορούν να χρησιμοποιηθούν ουσίες ενίσχυσης της κινητικότητας. Σε γενικές γραμμές, όσο καλύτερη είναι η κινητικότητα του σπέρματος πριν την κατάψυξή του, τόσο καλύτερη τείνει να είναι και μετά την απόψυξη.

Η κινητικότητα των σπερματοζωαρίων δεν φαίνεται να μας απασχολεί πολύ στην τεχνική της μικρογονιμοποίησης- εκεί η κινητικότητα αποτελεί απλώς ένδειξη βιωσιμότητας των σπερματοζωαρίων που θα επιλεγούν για τη μικρογονιμοποίηση.

 

Κατάψυξη ορχικού ιστού

Ποσοστό 80% των παιδιών που εμφανίζουν κάποια μορφή κακοήθειας επιβιώνουν. Ωστόσο, οι θεραπευτικοί χειρισμοί έχουν δραματικές συνέπειες στη γονιμότητά τους.

Σε αγόρια εφηβικής και προεφηβικής ηλικίας που έχουν διαγνωστεί με νεοπλασίες και πρόκειται να υποβληθούν σε γοναδοτοξικές θεραπείες, συντηρείται ορχικός ιστός και ορχικά γεννητικά κύτταρα που επαναμεταμοσχεύονται με στόχο την έναρξη της διαδικασίας της σπερματογένεσης και την αποκατάσταση της γονιμότητας αυτών των αγοριών.

Με δεδομένο το μικρό μέγεθος του οργάνου στην παιδική ηλικία, έχει προταθεί η κρυοσυντήρηση ολόκληρου του οργάνου με την προοπτική μιας αυτόλογης μεταμόσχευσης σε δεύτερο χρόνο. Στην περίπτωση αυτή ωστόσο, θα πρέπει να εξελιχθούν περαιτέρω οι τεχνικές κρυοσυντήρησης, ώστε να καταστούν με απολύτως ασφαλείς για το όργανο. Το καλό στη συγκεκριμένη περίπτωση, είναι ότι ήδη η επιστημονική κοινότητα διαθέτει εμπειρία από την κατάψυξη ωοθηκών.

Για τη μεταμόσχευση ορχικού ιστού, τα διαθέσιμα στοιχεία προέρχονται αποκλειστικά από πειραματόζωα, με αισιόδοξα αποτελέσματα. Ωστόσο, υπάρχει η αισιοδοξία ότι στο κοντινό μέλλον θα είναι πιθανή αυτόλογη μεταμόσχευση κατεψυγμένου ορχικού ιστού ασθενών, διαφυλάσσοντας την ικανότητά τους για γονιμοποίηση.

Οι τεχνικές αυτές εκτιμάται ότι θα τελειοποιηθούν τα επόμενα 20 με 30 χρόνια, προσφέροντας στους ασθενείς την ελπίδα απόκτησης των δικών τους παιδιών!

 

Βιβλιογραφία

1. Shufaro Y, Schenker JG. Cryopreservation of human genetic material. Ann N Y Acad Sci. 2010 Sep;1205:220-4. doi: 10.1111/j.1749-6632.2010.05651.x. PMID: 20840276.
2. Sharma V., Sperm storage for cancer patients in the UK: a review of current practice, Human Reproduction, Volume 26, Issue 11, November 2011, Pages 2935–2943, https://doi.org/10.1093/humrep/der281
3. Barrett SL, Woodruff TK. Gamete preservation. Cancer Treat Res. 2010;156:25-39. doi: 10.1007/978-1-4419-6518-9_3. PMID: 20811823; PMCID: PMC3086457.
4. Hauser R., Yogev L., Amit A., Yavetz H., Botchan A., Azem F. Et al., Severe Hypospermatogenesis in Cases of Nonobstructive Azoospermia: Should We Use Fresh or Frozen Testicular Spermatozoa?, Journal of andrology 2005; 26: 772-8.
5. Brougham MF, Kelnar CJ, Sharpe RM, Wallace WH. Male fertility following childhood cancer: current concepts and future therapies. Asian J Androl. 2003 Dec;5(4):325-37. PMID: 14695983.
6. Howell S, Shalet S. Gonadal damage from chemotherapy and radiotherapy. Endocrinol Metab Clin North Am. 1998 Dec;27(4):927-43. doi: 10.1016/s0889-8529(05)70048-7. PMID: 9922915.
7. Wallace WH, Anderson RA, Irvine DS. Fertility preservation for young patients with cancer: who is at risk and what can be offered? Lancet Oncol. 2005 Apr;6(4):209-18. doi: 10.1016/S1470-2045(05)70092-9. Erratum in: Lancet Oncol. 2005 Dec;6(12):922. PMID: 15811616.
8. Wyns C, Curaba M, Vanabelle B, Van Langendonckt A, Donnez J. Options for fertility preservation in prepubertal boys. Hum Reprod Update. 2010 May-Jun;16(3):312-28. doi: 10.1093/humupd/dmp054. Epub 2010 Jan 4. PMID: 20047952.